Collagenase aus Clostridium histolyticum

Kollagenase ist eine Protease, die das Dreifachhelix-Protein Kollagen spaltet. Es gibt drei Arten von Gewebekollagenasen, die zur Familie der Matrix-Metallproteinasen (MMP) gehören. Kollagenase aus Clostridium histolyticum besitzt eine sehr starke Aktivität, da sie Kollagen bei Temperaturen von nur 4 - 10 °C von beiden Enden her verdaut. Rohe Kollagenasemischungen enthalten zwei wesentliche Enzymtypen, nämlich Kollagenase und Clostripain.

Kollagenase aus Clostridium histolyticum wird für folgende Anwendungen eingesetzt:

• Isolierung von Sertolizellen
• Zum Vergleich von enzymatischen Verfahren
• Bei Gewebeaufbereitungen für die Immunzytochemie
• Extraktion von Spermien aus Hoden
• Herstellung von Einzelzellsuspensionen
• Immunfluoreszenz

Dieses Produkt eignet sich für die Disaggregation von humanen Tumor-, Mäusenieren, humanen adulten und fetalen Hirn-, Lungen- und vielen anderen Epithelgeweben. Es ist ebenfalls bei Leber- und Nierenperfusionsstudien, beim Pankreasverdau, bei der Isolierung von nicht-parenchymalen Rattenleberzellen und der Hepatozytenpräparation wirksam. Kollagenase wird auch bei der Aufbereitung von Arteriengewebe zur Untersuchung von fortgeschrittenen Glykosylierungsendprodukten verwendet. Dieses Enzym wurde für die Freisetzung von Hepatozyten bei einer Konzentration von etwa1 mg/ml getestet. Konzentrationen für den Aufschluss liegen im Bereich von 0,1 bis 5 mg/ml.

Geeignet zur Verwendung bei der Herstellung von Einzelzellsuspensionen für die Sequenzierung.

Collagenase wird durch vier Grammatom Calcium pro Mol Enzym aktiviert. Sie wird durch Ethylenglycol-bis-(beta-aminoethylether)-N, N, N′,N′-tetraessigsäure, β-Mercaptoethanol, Glutathion, Thioglycolsäure und 8-Hydroxychinolin gehemmt.

Das Kollagenase-Produkt ist ein Enzymgemisch, das von C. histolyticum sezerniert wird, wobei unterschiedliche Produkte durch die relativen Verhältnisse der 10 - 18 Komponenten in den sezernierten Enzymen differenziert werden. Die Hauptkomponenten sind zwei Kollagenasen: Clostripain und eine neutrale Protease. Die synergistische Aktion dieser Enzyme baut Kollagen und andere intrazelluläre Komponenten ab. Die Aktion von Kollagenase-Enzymen sowie der neutralen Protease ist für eine effektive Freisetzung von Zellen aus Gewebe erforderlich. Verschiedene Typen von Kollagen sind die natürlichen Substrate für Kollagenase.

Bei Lieferung ist dieses Produkt für die Dauer von einem Jahr bei -20 °C haltbar. Es kommt innerhalb von 30 Tagen bei 37 °C, 50 °C und -20 °C zu keinem Verlust bei der FALGPA- oder Proteaseaktivität. Lösungen von Rohkollagenase sind stabil, wenn sie schnell in Aliquoten (10 mg/ml) eingefroren und bei -20 °C tiefgekühlt gelagert werden. Weitere Gefrier-/Auftauzyklen schädigen die Lösung. Bei Lagerung auf Eis behält das Produkt seine gesamte Aktivität über 7 Stunden.

Eine Collagen-Aufschlusseinheit (Collagen Digestion Unit, CDU) setzt Peptide aus Rinder-Achillessehnencollagen entsprechend der Ninhydrin-Anfärbung von 1,0 μmol Leucin in 5 Stunden bei pH 7,4 und 37 °C in Gegenwart von Calciumionen frei. Eine FALGPA-Hydrolyseeinheit hydrolysiert 1,0 μmol Furylacryloyl-Leu-Gly-Pro-Ala pro Minute bei 25 °C. Eine neutrale Protease-Einheit hydrolysiert die Caseinmenge, die eine Färbung entsprechend 1,0 μmol Tyrosin pro 5 Stunden bei pH 7,5 und 37 °C produziert. Eine Clostripain-Einheit hydrolysiert 1,0 μmol BAEE pro Minute bei pH 7,6 und 25 °C in Gegenwart von DTT.

Diese Kollagenase wird aus dem Kulturfiltrat von Clostridium histolyticum gewonnen. Es wird davon ausgegangen, dass das Kulturfiltrat mindestens 7 verschiedene Proteasen mit einem Molekulargewicht von 68 - 130 kDa enthält. Dieses Produkt ist vom Typ I-A. Lösungen werden üblicherweise mit 1 - 2 mg/ml in TESCA-Puffer hergestellt (enthält 50 mM TES, 0,36 mM Calciumchlorid, pH 7,4 bei 37 °C).