Anti-phospho-Ubiquitin (Ser65)

Ubiquitin (Ub) wird anfangs produziert als Polyubiquitin-B-Vorläuferprotein mit 229 AS (UniProt P0CG47), das vom UBB-Gen (Gen-ID 7314) kodiert wird oder als Polyubiquitin-C-Vorläuferprotein mit 685 AS (UniProt P0CG48), das vom UBC-Gen (Gen-ID 7316) in Menschen kodiert wird. Die C-Termini von Polyubiquitin-B (Cys229) und Polyubiquitin-C (Val685) werden nach der Translation entfernt und anschließend erfolgen weitere posttranslationale Spaltungen, um mehrere identische Kopien von Ubiquitin-Molekülen mit 76 Aminosäuren (auch bekannt als High-Mobility-Group-Protein ohne Histon HMG-20) zu erhalten (drei Kopien pro Polyubiquitin-B und neun Kopien pro Polyubiquitin-C). Kovalente Modifizierungen von Zielproteinen durch verschiedene Ub-Lys-Reste, die während der zellulären DNA-Reparatur, ER-assoziierten Degradation (ERAD), Transkriptionsaktivierung, lysosomalen und proteasomalen Degradation auftreten, sind gut dokumentiert. PINK1 (PTEN-induzierte putative Kinase 1) ist eine Ser/Thr-Kinase, die sich in depolarisierten Mitochondrien spezifisch ansammelt und dort als positiver Regulator der E3-Ubiquitin (Ub)-Ligaseaktivität von Parkin (Park2) fungiert, indem sie Ub an Ser65 und den entsprechenden Ser-Rest an der N-terminalen Ub-ähnlichen (UBL) Domäne von Parkin phosphoryliert. Phosphoryliertes Ub interagiert mit phosphoryliertem Parkin an dessen GINGO0-Domäne auf allosterische Weise, wodurch eine Konformationsänderung induziert und die RING2-Domäne von Parkin katalytischem Cystein ausgesetzt wird, um volle Ligaseaktivität zu erzielen. Eine NMR-basierte Konformationsuntersuchung zeigt, dass an Ser65 phosphoryliertes Ub in Lösung in zwei Konformationen existiert. Die Hauptkonformation verfügt über veränderte Oberflächeneigenschaften, während die zweite phosphoUb-Konformation ein zum Ub-Kern hin um zwei Reste verkürztes C-terminales Ende aufweist. Die Ub-Ser65-Phosphorylierung hat nur eine geringe Auswirkung auf die E1-vermittelte E2-Ladung und beeinflusst vorwiegend die Entladung von E2-Enzymen, um polyUb-Ketten zu bilden. Darüber hinaus weisen die meisten Deubiquitinasen (DUB), einschließlich USP8, USP15 und USP30, nachweislich eine eingeschränkte Aktivität gegenüber Lys63-verknüpftem poly-phosphoUb auf.

Aufgrund der Sequenzhomologie von 100 % sind Reaktionen mit einem breiten Speziesspektrum zu erwarten.

Dieser polyklonale Antikörper detektiert nur an Ser65 phosphoryliertes Ubiquitin (Ub) und ubiquitinierte Proteine (darunter oligoUb und polyUb), die an Ser65 phosphoryliertes Ubiquitin enthalten. Bei fehlender Ub-Ser65-Phosphorylierung lässt sich keine Reaktivität gegenüber Ub oder ubiquitinierten Proteine erkennen.

An KLH konjugierte lineares Peptid, das der Ubiquitin-Zielregionensequenz entspricht, die phosphoryliertes Ser65 enthält.

Dieser poyklonale Kaninchenantikörper, Anti-phospho-Ubiquitin (Ser65), ist für die Verwendung in der Immunzytochemie und in Western Blots validiert und wird zum Nachweis der Ubiquitin-Ser65-Phosphoylierung eingesetzt.

Immunzytochemische Analyse: Mit einer repräsentativen Charge in einer Verdünnung von 1:500 wurde die durch die Behandlung mit CCCP (Best.-Nr. 215911) initiierte Ubiquitin-Ser65-Phosphorylierung in PINK1-exprimierenden HeLa-Zellen nachgewiesen.

Western-Blot-Analyse: Mit einer repräsentativen Charge in einer Verdünnung von 1:5.000 wurde die GST-PINK1-katalysierte Ser65-Phosphorylierung von rekombinantem Ubiquitin nachgewiesen.

Immunhistochemische Analyse: Mit einer repräsentativen Charge in einer Verdünnung von 1:200 wurde phospho-Ubiquitin (Ser65) in PINK1-exprimierenden HeLa-Zellen mit und ohne CCCP-Behandlung nachgewiesen. (Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Noriyuki Matsuda.)

Beurteilt mittels Western Blot in PINK1-exprimierenden HeLa-Zellen.

Western-Blot-Analyse: Mit einer Verdünnung dieses Antikörpers im Verhältnis 1:1.000 wurde die Induktion der zellulären Ubiquitin-Ser65-Phosphorylierung in 10 µg Lysat aus PINK1-exprimierenden HeLa-Zellen nach der Behandlung mit CCCP (Best.-Nr. 215911) nachgewiesen.

~ 17/8 und ~ 45–250 kDa gemessen. 8,565/17,112/25,66/34,21 kDa (mono-/di/tri-/tetra-Ubiquitin) berechnet. Die Banden mit ~ 45–250 kDa repräsentieren ubiquitinierte Proteine, die an Ser65 phosphoryliertes Ub enthalten. Nicht charakterisierte Banden können in manchen Lysaten beobachtet werden.

Ersetzt: ABS1513